Relações filogenéticas entre diferentes variedades de arroz

Autores: Bonacho, Diogo nº5; Oliveira, Afonso nº1; Oliveira, Miguel nº23; Santos, Marta nº19; 12ºA

No dia 03/05/2024 foi realizada a 1ª sessão deste trabalho, no âmbito da disciplina de Biologia, no ITQB (Instituto de Tecnologia Química e Biológica), em Oeiras, instituto este que se dedica à investigação e à formação avançada nas áreas da química e da biologia. O projeto está a ser supervisionado pela Investigadora Ana Fortunato, licenciada em bioquímica na Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa e doutorada em biologia pela Universidade NOVA. Atualmente, está inserida no projeto "FilliGRAIN-PROTECT - Usando o poder da integração de sinais da planta para proteger o enchimento de grãos contra stress". Stress este que é causado pelas alterações climáticas.

O objetivo do estudo das relações filogenéticas entre diferentes variedades de arroz é essencial para identificar as variedades mais resistentes às alterações climáticas, entender a evolução da cultura e orientar estratégias de conservação e melhoramento. Uma abordagem comum para investigar estas relações é a análise do DNA genómico, que fornece informações detalhadas sobre a estrutura genética e evolutiva das populações de arroz.

Neste trabalho, concentramo-nos na extração de DNA genómico como o primeiro passo para investigar as relações filogenéticas entre variedades de arroz. Através desta técnica, podemos obter informações valiosas sobre a diversidade genética dentro e entre populações de arroz, identificando padrões de variação genética e avaliando a relação entre diferentes variedades.

A extração de DNA genómico é um processo fundamental que estabelece as bases para uma ampla gama de análises genéticas, incluindo sequenciamento de DNA, análise de marcadores moleculares e construção de árvores filogenéticas. Neste trabalho, descrevemos o procedimento utilizado para a extração de DNA genómico de variedades de arroz, destacando a importância desta etapa inicial na investigação das relações filogenéticas.

Ao compreendermos melhor a estrutura genética das populações de arroz e as relações filogenéticas entre variedades, podemos identificar as variedades mais resistentes às alterações climáticas, entender a evolução da cultura e orientar estratégias de conservação e melhoramento.

Procedimento da extração de DNA genómico:

1. Colocar cerca de 100mg de folhas de plantas de arroz no almofariz. Com uma micropipeta de 1000μl e uma ponta adequada, pipetar 2 vezes 750μl de tampão de extração (200mM Tris-HCl pH 7.5, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS).

2. Macerar até obter uma mistura homogénea.

3. Transferir a mistura para um microtubo.

Este procedimento foi repetido 6 vezes para todas as amostras de material vegetal.

Nota:  O almofariz deve ser sempre lavado antes de entrar em contacto com uma nova amostra.

fig.1

fig.3

fig.2

4. Centrifugar por 2 minutos à velocidade máxima.

fig.4

5. Transferir o sobrenadante para um novo microtubo corretamente identificado e adicionar igual volume de isopropanol frio. Descartar o microtubo que contém o precipitado.

fig.5

6. Incubar o novo microtubo em gelo durante 20 minutos.

7. Centrifugar por 5 minutos à velocidade máxima.

fig.6

8. Retirar o sobrenadante e secar o microtubo que contém o precipitado ao ar.

9. Re-suspender o "pellet" em 100μl de tampão TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA).

10. Verificar a integridade do DNA em gel de agarose.

Explicação do procedimento:

O tampão Tris-HCl ajuda a manter um pH neutro de 7.5, enquanto o EDTA impede que catiões formem ligações com ácidos nucleicos ao incorporar esses catiões na sua estrutura. O SDS é um detergente que ajuda a solubilizar proteínas e a destabilizar fosfolípidos da membrana.

A maceração auxilia na quebra do material em partes menores, aumentando a área de contacto, permitindo que os reagentes atuem de maneira mais efetiva na extração do DNA. A aplicação de força mecânica pode também romper a membrana celular de algumas células.

A 1ª centrifugação serve para separar a membrana celular do resto do conteúdo celular.

O isopropanol faz precipitar o DNA.

A 2ª centrifugação purifica e precipita o DNA ao isolar o mesmo do resto da solução.

Algumas precauções a ter:

• Uso de luvas e bata laboratorial;

• Ao pipetar, não sobrecarregar o botão pois irá pipetar uma quantidade maior que a pretendida;

• Ao centrifugar os microtubos, equilibrar a distribuição de peso na centrifugadora: