Experiências de genética com variantes de arroz- sessão 2

6474beatrizneves
13 de mai. de 2024
3 min de leitura

Trabalho realizado por: Leitão, Margarida nº16; Martins, Maria nº17; Neves, Beatriz nº4; Silva, Mariana nº 18

No dia 10/05/2024 no âmbito da disciplina de Biologia (12º ano), um grupo de alunos da Escola Secundária Quinta do Marquês dirigiu-se pela segunda vez ao ITQB para realizar uma segunda sessão do projeto destinado à extração do DNA do arroz.

PCR:

O que é? – A técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica laboratorial que permite produzir rapidamente milhões de cópias de um segmento específico de DNA, in vitro.

Como se faz? – Nesta técnica são necessários primers para iniciar o processo de replicação. São utilizados primers de DNA sintetizados quimicamente, que apenas hibridizam com a sequência complementar exata do DNA da amostra. Deste modo é possível determinar com exatidão a região do DNA a ser amplificada.

Para realizar este processo é necessário:

o Primers de DNA

o DNA polimerase

o Nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

o Uma solução tampão com iões Mg2+

E devem seguir-se os seguintes passos:

1. Colocar as amostras no microtubo

2. Adicionar o DNA

3. Repetir o passo 1 e 2 para todos as amostras de DNA

4. Colocar as amostras no termociclador

5. Programar o termociclador

Depois de criar a mistura de reagentes, esta é aquecida a 95ºC (desnaturação do DNA), originando duas cadeias simples. De seguida a mistura é arrefecida a 45º/65ºC (ligação dos primers à cadeia molde). Por fim a mistura é aquecida a 72ºC permitindo a ação da DNA polimerase.

Nos ciclos seguintes a mistura é sujeita à mesma sequência de variações de temperatura.

Para que serve? - A sua finalidade é a produção de cópias de um segmento específico de DNA, rapidamente.

Eletroforese:

O que é? – Esta técnica é muito utilizada e tem um papel muito importante na análise laboratorial e nas pesquisas cientificas. Tem como objetivo a separação de macromoléculas como o DNA, RNA, proteínas e enzimas com diferentes tamanhos e cargas.

Como se faz?

1. Preparar o gel de agarose, que atua como peneira para separar os ácidos nucleicos.

2. Após o arrefecimento do mesmo, este é transferido para a tina de eletroforese.

3. Com o auxílio de micropipetas, as amostras de DNA são colocadas nos poços de agarose.

4. Repetir o passo 3 para cada amostra, e colocar as amostras de DNA sempre em poços diferentes

5. Os elétrodos metálicos são ligados às extremidades da tina.

Como os fragmentos de DNA estão carregados negativamente, então movem-se na direção do eletrão positivo e dependendo do seu tamanho podem percorrer várias distâncias. Quanto maior for o fragmento, menor será a distância percorrida.

Para que serve?

Esta técnica tem como principal objetivo a separação de macromoléculas como o DNA, RNA, proteínas e enzimas com diferentes tamanhos e cargas.

Procedimento:

1. Identificar dois micro tubos com R e M respetivamente

2. Identificar outros dois micro tubos com R- e M- respetivamente

3. Identificar 10 micro tubos com números de 1 a 10 e a letra R

4. Repetir o passo 3 para a letra M

5. Para cada um dos micro tubos (M e R) preparar a mistura consoante os valores da tabela 1

6. Para cada micro tubo (M e R) adicionar os primers consoante a tabela 2

7. Colocar 24 µl da solução do micro tubo M nos tubos M e M-

8. Repetir o passo 7 para R

9. Colocar 1 µl de cada amostra de DNA extraído em cada um dos tubos M e R

10. Colocar 1 µl de água ultra pura em cada um dos tubos M- e R-;

11. Colocar as amostras finais no termociclador

Tabela 1

Componente	Volume
GoTaq Buffer 5x	84 µl
MgCl2 (25mM)	33.6 µl
Mistura de dNTPs 10 mM	10.5 µl
Iniciador F 10 uM (“primer” Foward)	16.8 µl
Iniciador R 10 uM (“primer” Reverse)	16.8 µl
GoTaq DNA polimerase (1 U/µl)	3.36 µl
Água ultrapura	170.94 µl