Experiências de genética com variantes de arroz - Projeto ITQB (sessão 2)

Autores: Awan, Laila nº12; Bernardo, Leonor nº13; Brito, Teresa nº24; Magalhães, Manuel nº14

PCR

O que é

O teste PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica laboratorial que consiste na replicação sucessiva de uma região específica de DNA in vitro. Ou seja, produz cópias das regiões de DNA desejadas.

Como se faz

Para realizar uma amplificação por PCR, são necessários os seguintes componentes: 

• Taq DNA polimerase;

• Nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);

• Primers de DNA;

• Tampão PCR (solução com Mg2+);

Deve seguir-se as seguintes etapas: 

1. Colocar os componentes num microtubo; 

2. Adicionar o DNA em estudo; 

3. Realizar os passos 1 e 2 para todas as amostras de DNA; 

4. Colocar as amostras num termociclador; 

5. Programar o termociclador para que este efetue 35 ciclos (nota 1) de oscilações de temperatura (nota 2). 

As oscilações de determinadas temperaturas permitem os processos que dão origem à replicação do DNA. Tal acontece, porque a separação das duas cadeias de DNA e a atuação da enzima DNA-polimerase ocorrem a temperaturas específicas.

nota 1: Geralmente são realizados 35 ciclos, no entanto, dependendo da investigação em curso, podem ser realizados mais ou menos. 

nota 2: As oscilações de temperatura variam entre os 50°C e os 95°C. 

As principais etapas de cada ciclo são:

Desnaturação (95°C): a temperatura aumenta para desnaturar o DNA, ou seja, quebrar as ligações de hidrogénio entre as duas cadeias, dando origem a duas cadeias simples de DNA. 

Emparelhamento (48°C): a temperatura diminui para permitir a ligação dos primers, por pontes de hidrogénio, às suas sequências complementares na cadeia-molde de DNA. 

Amplificação (72°C): a temperatura da reação aumenta para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas cadeias de DNA. 

Para que serve

O PCR tem como objetivo aumentar exponencialmente a quantidade de DNA, permitindo a sua visualização na técnica de eletroforese e consequente análise. 

Eletroforese

O que é 

A eletroforese é uma técnica utilizada para separar os fragmentos de DNA, RNA e proteínas com base no seu tamanho. Esta separação realiza-se através da aplicação de uma corrente elétrica numa tina com gel que contém os fragmentos. Assim, estes separam-se, de acordo com a sua dimensão, ao longo da tina.

Como se faz 

Para realizar a eletroforese, separa-se amostras do material em estudo. No caso do trabalho desenvolvido no ITQB, separou-se amostras de fragmentos de DNA extraído de variantes de arroz.

Posteriormente, segue-se as seguintes etapas: 

1. Colocar o gel de agarose numa tina de eletroforese; 

2. Colocar a amostra de DNA, com uma micropipeta, no poço de agarose; 

3. Repetir o passo 2 com cada amostra em estudo, colocando-as em poços diferentes; 

4. Ligar o elétrodo negativo à extremidade da tina mais próxima aos poços de agarose; 

5. Ligar o elétrodo positivo à outra extremidade da tina.
   

Os elétrodos provocarão uma corrente elétrica na tina. O DNA, devido aos grupos fosfato, tem naturalmente uma carga negativa, sendo atraído para a outra extremidade da tina, onde se encontra o elétrodo positivo. Os fragmentos migram em direção ao elétrodo positivo e, dependendo dos seus tamanhos, percorrem distâncias diferentes. Os fragmentos menores movem-se mais do que os maiores.

Para que serve 

A realização da eletroforese permite visualizar-se as diferentes bandas de DNA, de acordo com o seu tamanho, no gel de agarose. No nosso estudo, realizamos a eletroforese como uma técnica de controlo, de forma a assegurarmos a presença de DNA genómico nas amostras. Desta forma, também foi possível determinar a sua integridade, a sua concentração e o seu grau de pureza. Posteriormente, a técnica será utilizada novamente para se visualizar os produtos resultantes do PCR. 

A eletroforese também tem outras aplicações onde é necessária a comparação do DNA, tal como: na área da ciência forense, na investigação biológica (como na identificação de microrganismos ou de mutações) e na realização de testes de paternidade.

Procedimento

1. Identificar dois micro tubos como M e R, respetivamente;

2. Identificar dois micro tubos como M- e R-, respetivamente;

3. Identificar 10 micro tubos com a letra m e números de 1 a 10 (todos os micro tubos devem ter números diferentes);

4. Repetir o passo anterior para a letra r;

5. No micro tubo M, preparar a mistura de reação de acordo com a tabela 1;

6. Repetir o passo 5 para o micro tubo R;

7. Adicionar os primers aos tubos de acordo com a tabela 2;

8. Distribuir 24 µl da solução do micro tubo M nos tubos com a letra m e no M-;

9. Distribuir 24 µl da solução do micro tubo R nos tubos com a letra r e no R-;

10. Colocar 1 µl de cada amostra de DNA extraído previamente em cada um dos tubos m e r (cada tubo da mesma letra deve ter uma amostra de DNA diferente dos restantes);

11. Colocar 1 µl de água ultra pura em cada um dos tubos M- e R-;
    

12. Colocar as amostras no termociclador;

13. Programar o termociclador de acordo com a imagem 1.

Tabela 1

Componente	Volume Total
GoTaq Buffer 5x	84 µl
MgCl2 (25mM)	33,6 µl
Mistura de dNTPs 10 mM	10,5 µl
Iniciador F 10 uM (“primer” Foward)	16,8 µl
Iniciador R 10 uM (“primer” Reverse)	16,8 µl
GoTaq DNA polimerase (1 U/µl)	3,36 µl
Água ultrapura	170,94 µl

Tabela 2

Tubo	Tipo de Primer	Primer utilizado
M	"primer" Forward	PMKF
	"primer" Reverse	PMKR
R	"primer" Forward	PRBF
	"primer" Reverse	PRBR

Imagem 1

Conceitos:

• Taq DNA polimerase: enzima ideal para o PCR por ser bastante estável a temperaturas elevadas, que são necessárias para desnaturar o DNA. Tem como função amplificar os fragmentos de DNA.

• Primers de DNA: sequências complementares de regiões específicas do DNA que indicam o local onde a DNA-polimerase deve atuar para realizar a replicação. A seleção dos primers a utilizar determina os genes que serão amplificados.

• Termociclador: máquina laboratorial na qual é possível controlar a temperatura do seu interior.