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Amplificação de sequências específicas de DNA

Autores: Bonacho, Diogo nº5; Oliveira, Afonso nº1; Oliveira, Miguel nº23; Santos, Marta nº19; 12ºA


No dia 10/05/2024, foi realizada a 2ª sessão deste projeto. Nesta sessão tínhamos como objetivo comparar dois genes específicos (matK e rbcL) dos indivíduos, isolando, em cada amostra de arroz, o gene que codifica estes dois genes.

Para isto foi feita uma eletroforese em gel de agarose e uma amplificação in vitro de sequências específicas de DNA (PCR).


Conceitos:

Maturase K (matK) = Gene das plantas envolvido no processamento de outros genes.

Ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase (rbcL) = Gene exclusivo das plantas, responsável pela produção da ribulose-1,5-bifosfato, ou RuBisCo, a substância converte o dióxido de carbono e água em carboidratos.

Taq DNA polimerase = É uma enzima que catalisa a síntese de polinucleotídeos em reações de PCR.

Primers de DNA = Segmentos de ácidos nucleicos, com 1 a 60 ribonucleotídeos necessários à iniciação da replicação do DNA.

Termocicladora = Máquina laboratorial que provoca variações sucessivas de temperatura.


Eletroforese em gel de agarose:

O que é?

  • Técnica laboratorial que tem como principal objetivo separar moléculas de DNA e de RNA.

  • Bastante utilizada em projetos de pesquisa e laboratório por ser muito simples e de baixo custo, e que, posteriormente, permite obter o diagnóstico de doenças, verificar a expressão de proteínas, e serve ainda também para identificar microrganismos.

  • Possui uma grande vantagem pois, ao utilizar esta técnica, o DNA pode ser recuperado sem qualquer tipo de dano.

Como se faz?

1. Utiliza-se um gel que é introduzido numa solução tampão específica para a eletroforese.

2. De seguida, as amostras são pipetadas em pequenos poços, feitos com um pente no gel.

3. Coloca-se num dos poços os controlo positivo, ou seja, a substância conhecida, e noutro poço, o controlo negativo, para equilibrar a reação e consequentemente garantir a validade da mesma.

4. Coloca-se o gel na cuba de eletroforese.

5. Por fim, as bandas são visualizadas sob uma luz ultravioleta ou LED, através de um transiluminador.

Para que serve?

Esta técnica possui diversas utilidades, como por exemplo:

  • Verificar a expressão de proteínas;

  • Identificar mutações;

  • Teste de paternidade;

  • Identificar vírus, fungos, bactérias, parasitas, etc.;

Uma curiosidade sobre a eletroforese, é que a eletroforese de proteínas também pode ser usada para ajudar no diagnóstico de diversos problemas de diabetes, tiroide e doenças hepáticas.


Reação polimerase em cadeia (PCR): Tecnologia que consiste na amplificação de uma região específica de DNA. A partir deste método é possível produzir uma quantidade enorme de cópias de pequenas porções do DNA que se deseja estudar. Assim, ainda que a quantidade de DNA disponível na amostra seja muito pequena, a PCR torna possível a análise do material.

O que é? 

A técnica PCR (reação da polimerase em cadeia) consiste na réplica de várias cópias de sequências específicas de DNA de forma rápida e eficaz.

A PCR foi inventada em 1983 pela bioquímica americana Kary Mullis, que mais tarde viria a ganhar o prémio Nobel de química em 1993 pela sua descoberta. Esta técnica é essencial para vários testes e estudos na área da genética e desde a sua invenção é amplamente utilizada em laboratório com diversas aplicações, em concreto nesta sessão, é usada no estudo das relações filogenéticas entre espécies de arroz.

O número de cadeias de DNA aumenta exponencialmente. A fórmula 2(nº de ciclos + 1) dá o nº de cadeias de DNA presente na amostra em funções dos ciclos realizados, assim conseguimos prever que ao fim de 35 ciclos teremos aproximadamente 68 mil milhões de cadeias de DNA.

fig. 1

A utilização da enzima Taq polimerase neste procedimento é fundamental, pois a mesma confere estabilidade mesmo a temperaturas elevadas.

A Taq polimerase foi originalmente retirada de uma bactéria que habita fontes termais.

Como se faz?

A PCR é um processo de 3 etapas realizado em ciclos repetidos a partir de uma termocicladora:

  1. Desnaturação - 95ºC

  2. Emparelhamento/hibridização - 48ºC

  3. Amplificação/extensão - 72ºC


Explicação dos ciclos:

  • A desnaturação separa as duas fitas de DNA.

fig. 2

  • No emparelhamento, os iniciadores ou primers (fita de DNA específica para o gene que se pretende estudar) complementam uma fita de sentido oposto, consequentemente é preciso um iniciador senso (forward), que se liga à cadeia 3'-5', e um iniciador antissenso (reverse), que se liga à cadeia 5'-3'. O segmento de DNA que se pretende estudar está dependente do primer inserido nesta fase.

fig. 3
fig. 4















  • Na amplificação, a temperatura é elevada de modo a possibilitar a sintetização de uma nova cadeia de DNA, a partir dos dNTPs, complementar à cadeia modelo, a partir das extremidades dos primers no sentido 5'-3'

fig. 5

Para que serve?

Os usos da técnica PCR são amplamente reconhecidos na área da genética. Foi utilizada na maioria das técnicas de mapeamento no Projeto Genoma Humano, é utilizada na área das ciências forenses na comparação de sequências de nucleótidos únicos entre indivíduos (DNA fingerprinting ou profiling), na deteção de bactérias ou vírus (particularmente AIDS), no estudo da filogenia e no diagnóstico de doenças genéticas.

Na pandemia do COVID-19, o teste PCR era considerado o mais fiável, com uma eficácia de quase 98.5%, em contrapartida, era o teste mais demorado à COVID-19.



Procedimento da amplificação in vitro de sequências específicas de DNA (PCR):

1. Separar 20 tubos de PCR, identificá-los com números de 1 a 10, 10 com a letra M e 10 com letra R.

2. Separar outros 2 tubos de PCR e identificá-los com as letras M- e R-.

3. Separar também 2 microtubos e identificá-los apenas com as letras M e R.

fig. 6

4. Preparar as misturas M e R:

Componentes

Volume total

GoTaq Buffer 5x 

84µl 

MgCl2 (25mM) 

33,6µl 

Mistura de dNTPs 10 mM 

10,5µl 

Iniciador F 10 µM (“primer” Foward) 

16,8µl 

Iniciador R 10 µM (“primer” Reverse) 

16,8µl 

GoTaq DNA polimerase (1 U/µl)  

3,36µl 

Água ultrapura 

170,94µl

tab. 1

Tubo

Iniciador utilizado

M

PMKF (forward)

M

PMKR (reverse)

R

PRBF (forward)

R

PRBR (reverse)

tab. 2

5. Verificar a integridade da solução ao colocar respetivamente as misturas M e R nos tubos de controlo, M- e R-.

6. Colocar 24µl da mistura M nos 10 tubos de PCR previamente identificados, colocar a mesma quantidade da mistura R nos tubos de PCR adequados.

7. Pegar nas  10 amostras de arroz preparadas na sessão anterior e colocar em cada par de microtubos M e R, 1µl de DNA.

8. Nos tubos M- e R- colocar 1 µl de água ultrapura.

fig. 7

Explicação do procedimento:

Com esta técnica queremos fazer muitas cópias de uma região específica do DNA. É importante realçar que a Taq polimerase é uma enzima que irá produzir novas fitas de DNA usando as existentes como moldes, a Taq polimerase só consegue fabricar DNA quando lhe é atribuído um primer  (“primer" forward) ou (“primer” reverse), que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA. Foi adicionada também uma mistura de dNPTs (desoxirribonucleótidos trifosfato), sendo estas bases nitrogenadas ligadas com os denominados primers e a enzima DNA, para poupar tempo de manuseamento e a possibilidade de contaminação.  Foram usados dois tubos (M- e R-) como um grupo de controlo para verificar se existe alguma contaminação nas amostras.

Nota:  No nosso caso identificámos os tubos com os números 40 a 49, da seguinte forma: 40M, 40R, 41M,..., 49M, 49R.


Precauções a ter:

  • Usar bata e luvas;

  • Medir e pipetar rigorosamente as misturas;

  • Utilizar as pipetas respetivas à escala;

  • Quando pipetar o sobrenadante das amostras de DNA certificar que nenhum sedimento foi recolhido pela pipeta.


Bibliografia:



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© Nuno Meia-Onça - Saladasciências

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